Cella di programmazione

Apr 29, 2023

Nature Chemical Biology volume 18, pagine 385–393 (2022)Citare questo articolo

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I biosensori senza cellule sono potenti piattaforme per il monitoraggio della salute umana e ambientale. Qui, espandiamo le loro capacità interfacciandoli con circuiti di spostamento dei filamenti mediati dal puntale, una nanotecnologia dinamica del DNA che consente il calcolo molecolare attraverso interazioni programmabili tra filamenti di acido nucleico. Sviluppiamo regole di progettazione per interfacciare una piattaforma di rilevamento di piccole molecole chiamata ROSALIND con spostamento del filamento mediato dall'appoggio per costruire circuiti ibridi RNA-DNA che consentono la regolazione fine della cinetica di reazione. Utilizziamo queste regole di progettazione per costruire 12 circuiti diversi che implementano una gamma di funzioni logiche (NOT, OR, AND, IMPLY, NOR, NIMPLY, NAND). Infine, dimostriamo un circuito che agisce come un convertitore analogico-digitale per creare una serie di uscite binarie che codificano l'intervallo di concentrazione della molecola rilevata. Riteniamo che questo lavoro stabilisca un percorso per creare una diagnostica "intelligente" che utilizzi calcoli molecolari per migliorare la velocità e l'utilità dei biosensori.

Il biosensing senza cellule sta emergendo come una piattaforma tecnologica diagnostica a basso costo, facile da usare e implementabile sul campo in grado di rilevare una gamma di composti chimici correlati alla salute umana e ambientale1,2. Fondamentalmente, questi sistemi sono costituiti da due strati: uno strato di biosensore basato su RNA o proteine ​​e uno strato di output della struttura reporter. Collegando geneticamente questi strati, viene generato un segnale quando il composto bersaglio si lega al biosensore e attiva l'espressione del reporter (Fig. 1). Le reazioni vengono assemblate incorporando questi strati all'interno di sistemi privi di cellule e liofilizzandoli per un facile stoccaggio, trasporto e reidratazione con un campione di interesse nel punto di necessità1,3. Utilizzando questo approccio, i biosensori senza cellule hanno rilevato con successo composti correlati alla salute umana come lo zinco4 e le molecole di rilevamento del quorum di batteri patogeni5, farmaci come il gamma-idrossibutirrato6 e contaminanti dell'acqua come fluoruro1, atrazina2, antibiotici e metalli pesanti7.

(Superiore) Un biosensore privo di cellule si attiva tipicamente quando un composto bersaglio (input) si lega a un fattore di trascrizione proteica (strato sensore) che è configurato per attivare l'espressione di un costrutto reporter (strato di output). Ciò si traduce nella produzione di un segnale rilevabile come la fluorescenza. (Inferiore) L'aggiunta di uno strato di elaborazione delle informazioni a valle prima della generazione del segnale può migliorare le prestazioni ed espandere la funzione dei biosensori privi di cellule aggiungendo funzionalità computazionali come l'elaborazione logica e il confronto del segnale. In questo caso, ciò viene implementato cablando lo strato di uscita del biosensore per produrre un RNA a filamento singolo in grado di attivare circuiti di spostamento del filamento mediati dal puntale che generano il segnale.

Tuttavia, i biosensori esistenti senza cellule spesso mancano di uno strato di elaborazione delle informazioni in grado di manipolare le risposte dello strato di rilevamento prima della generazione del segnale (Fig. 1). Tali strati di elaborazione delle informazioni sono una caratteristica naturale degli organismi e consentono alle cellule di attivare risposte allo stress, guidare lo sviluppo e prendere decisioni comportamentali sulla base di segnali intracellulari ed extracellulari8. Per questo motivo, gli strati di elaborazione delle informazioni genetiche che implementano logica e feedback sono stati ampiamente sfruttati e progettati in sistemi cellulari sintetici9,10. Allo stesso modo, abbiamo precedentemente dimostrato che i circuiti basati su RNA possono essere aggiunti a una piattaforma di biosensori senza cellule chiamata RNA Output Sensors Activated by Ligand INDuction (ROSALIND) per migliorare la loro specificità e sensibilità senza ingegnerizzare i biosensori proteici7. Tuttavia, questi circuiti agiscono ancora direttamente sullo strato di rilevamento o su quello di uscita, limitando la nostra capacità di migliorare ed espandere la loro funzione.

Qui, sviluppiamo uno strato di elaborazione delle informazioni generalizzabile per migliorare ed espandere la funzione di ROSALIND sfruttando lo spostamento del filamento del DNA mediato dal puntale (TMSD), una nanotecnologia del DNA computazionalmente potente in grado di elaborare le informazioni molecolari in vitro11. Nella TMSD, gli input di DNA a filamento singolo (ssDNA) scambiano filamenti con "porte" di DNA a doppio filamento tramite interazioni di accoppiamento di basi complementari per produrre filamenti di output di ssDNA. Configurando le porte del DNA in diverse architetture di rete, è possibile eseguire una serie di operazioni come il ripristino del segnale12, l'amplificazione del segnale13 e il calcolo logico14,15, proprio come un'architettura computazionale chimica generale16. La termodinamica ben caratterizzata dell'accoppiamento delle basi del DNA consente di costruire reti di grandi dimensioni partendo da semplici elementi costitutivi. Inoltre, la cinetica della reazione può essere regolata con precisione modificando la forza degli "appigli", regioni a filamento singolo all'interno delle porte del DNA che avviano il processo di spostamento del filamento17. Il TMSD ha portato allo sviluppo di potenti dispositivi tra cui oscillatori in vitro18, amplificatori catalitici19, motori molecolari autonomi20,21 e nanostrutture di DNA riprogrammabili22,23. Pertanto, esiste un grande potenziale per l’elaborazione delle informazioni basata su TMSD per migliorare i biosensori privi di cellule.